CEBEDEAU • Projet Microsense

Contexte et objectifs du projet

Le projet Microsense, financé par la Région wallonne dans le cadre du programme Win4Collective, s’est déroulé sur une période de 30 mois et a réuni deux partenaires de recherche complémentaires : le CEBEDEAU et le Centre wallon de Recherches agronomiques (CRA-W).

L’objectif principal du projet était de développer des outils analytiques innovants, rapides et transposables sur le terrain, permettant d’évaluer la qualité environnementale des matrices eau (CEBEDEAU) et sol (CRA-W). Contrairement aux approches analytiques classiques, souvent basées sur la détection directe de molécules polluantes, Microsense s’appuie sur une stratégie indirecte exploitant la réponse biologique des communautés microbiennes.

Cette approche repose sur le principe que certaines bactéries ou certains gènes microbiens répondent de manière spécifique à la présence de polluants, et peuvent ainsi constituer des bioindicateurs (espèces bactériennes) ou des biomarqueurs (gènes fonctionnels) révélateurs de pollutions actuelles ou historiques.

Sélection des polluants et dispositif expérimental

Les travaux ont porté sur des produits phytopharmaceutiques (PPP) largement utilisés en Région wallonne, et présentant un intérêt particulier en termes de pression environnementale actuelle ou future. Après un screening approfondi basé sur des critères de pertinence territoriale et environnementale, cinq PPP ont été retenus : deux fongicides et trois herbicides.

Des tests pilotes en laboratoire ont été mis en place afin d’identifier des réponses microbiologiques spécifiques à ces polluants. Des bioréacteurs indépendants ont été alimentés avec de l’eau usée de station d’épuration, soumise à des concentrations élevées de PPP sur plusieurs semaines. Des campagnes de prélèvements régulières ont permis de suivre :

• l’évolution des communautés bactériennes,

• les variations du contenu génétique en fonction des traitements appliqués.

Analyse des communautés bactériennes – Métabarcoding 16S

L’identification des bioindicateurs bactériens a été réalisée à l’aide de la technique de métabarcoding, basée sur le séquençage du gène ARNr 16S, un marqueur phylogénétique universel chez les bactéries.

L’ADN total extrait des échantillons a été amplifié, puis séquencé afin de caractériser l’ensemble des taxons bactériens présents. Cette approche a permis de comparer les communautés microbiennes entre les différents traitements (contrôle vs exposition aux PPP) et d’identifier des espèces dont l’abondance variait de manière significative en réponse à certains polluants.

Identification des biomarqueurs – Approche métagénomique

En complément, une approche métagénomique globale a été utilisée afin d’identifier des gènes biomarqueurs associés à la présence de PPP. L’ensemble du matériel génétique des échantillons a été séquencé, puis :

• assemblé,

• annoté fonctionnellement,

• comparé entre les différents traitements.

Cette stratégie a permis d’identifier des gènes spécifiques ou fortement enrichis dans certains contextes de pollution, notamment des gènes impliqués dans la réponse au stress membranaire ou dans la dégradation de composés aromatiques.

Résultats principaux

Les analyses bioinformatiques ont conduit à l’identification de :

Bioindicateurs bactériens

• Dokdonella immobilis, dont l’abondance augmente de manière systématique en présence de l’ensemble des polluants testés.

• Pseudoxanthomonas dokdonensis, présentant une augmentation significative de sa population en réponse à l’herbicide S-métolachlore.

Biomarqueurs génétiques

• Quatre gènes associés à la réponse au stress de la membrane cellulaire :

  • K00021 et K01641, détectés en présence des fongicides fluopyram et prothioconazole ;

  • K04708 et K16436, détectés en présence des fongicides tébuconazole et prothioconazole.

• Un gène impliqué dans le clivage du cycle benzénique :

  • ccmtc_K1062, détecté en présence de l’herbicide S-métolachlore et des fongicides tébuconazole et prothioconazole.

Ces biomarqueurs se sont révélés particulièrement pertinents pour la détection de pollutions aux fongicides triazolés, qu’elles soient ponctuelles ou chroniques.

Validation et transposition vers le terrain

Afin de rendre ces résultats opérationnels, les biomarqueurs identifiés ont été validés par qPCR, permettant une quantification précise du nombre de copies de gènes cibles. Des paires d’amorces spécifiques ont été développées et testées lors d’un second essai pilote, incluant un nombre accru de réplicats afin d’assurer la robustesse des résultats.

Dans une optique d’application terrain, cette approche est transposable via la technologie LAMP-qPCR, ouvrant la voie au développement d’outils de détection rapides, portables et peu coûteux.

Concernant les bioindicateurs bactériens, le projet a exploré le développement de tests rapides basés sur des aptamères. Ces fragments d’ADN, capables de se lier spécifiquement à une cible bactérienne, peuvent être intégrés dans des aptasenseurs, analogues aux tests immunologiques rapides. La sélection d’aptamères spécifiques repose sur la méthodologie Cell-SELEX, actuellement en phase d’optimisation.

Conclusion et perspectives

Le projet Microsense a permis de démontrer la pertinence de la microbiologie environnementale comme outil indirect de surveillance des pollutions par pesticides. Les biomarqueurs identifiés constituent une base solide pour le développement de solutions analytiques innovantes destinées à la surveillance de la qualité de l’eau et des sols.

Les perspectives du projet incluent :

• la finalisation d’un kit de preuve de concept (POC) basé sur la technologie LAMP-qPCR pour la détection de pollutions aux triazolés,

• l’optimisation de la méthodologie Cell-SELEX en vue du développement d’un aptasenseur fonctionnel pour les bioindicateurs bactériens.